样品要求:
iTRAQ和TMT是分别由美国AB Sciex公司和Thermo公司研发的多肽体外标记定量技术,采用8种或10种同位素标签,通过特异性标记多肽的氨基酸基团,一次上机可实现8种或10种不同样本中蛋白质的相对定量,是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。
样品要求:
样品类型 |
样品要求(/样本) |
蛋白质提取物 |
浓度>1ug/ul,蛋白质总量>300ug |
细胞样本 |
细胞量>107个细胞 |
组织样本 |
动物/植物新鲜组织>200mg |
体液样本 |
血液体积>500ul,无溶血 |
微生物样本 |
>50mg或者离心后体积>100ul |
技术原理:
iTRAQ和TMT技术原理类似,以iTRAQ试剂为例,该试剂结构由报告基团、中性平衡基团和反应基团三部分组成。不同报告基团及其相对应平衡基团的质量和都相同,而反应基团能与赖氨酸ε氨基和所有肽链的氨基末端连接,可标记所有氨基酸。
不同标记试剂与来源于不同样品胰酶消化后的肽段结合,经过色谱分离,并通过一级质谱和二级质谱。平衡基团在二级质谱时发生中性丢失,而报告基团在二级质谱低质量区域产生多个报告离子,其信号强度分别代表该标记样品的表达量,根据报告离子的峰面积计算同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值,从而实现蛋白的相对定量。
tims TOFpro:
QE, QE-Plus或HF
流程及报告内容:
整个实验分为预实验和正式实验部分,总实验周期为6周。预实验部分包括:蛋白样品制备,蛋白定量,SDS-PAGE胶,蛋白酶解,质谱预实验,出具预实验报告。以确保蛋白和肽段样品符合正式实验的要求。
正式实验部分包括:ITRAQ标签标记,SCX色谱分级,正式实验质谱分析,数据库检索及出具正式实验报告。
报告内容包括实验原理,实验流程,实验试剂仪器,实验步骤及参数,实验结果。
分析数据:全部检测蛋白的登录号及名称,分子量、等电点、肽段数等常规数据,蛋白定量数据及相应的p值。
生物信息学分析数据:统计学差异表达蛋白的GO,pathway,network分析报告。
RAW文件:质谱原始数据文件
技术优势:
1. 通量高,不受样本数目的限制
单次上机最多可以同时进行8个样品(iTRAQ)或10个样品(TMT)蛋白的鉴定和定量,
超过8个样品(iTRAQ)或10个样品(TMT)可以通过设置内参,形成搭桥,实现多次上机数据之间的比较,不受样本数目的限制。
2. 定量准确,重复性高
不同样本标记之后混样,统一处理、上机,与非标记定量样本单独处理、上机相比,
减少了样本处理和上机造成的实验误差,提高了定量的准确性和重复性。
3. 蛋白检测范围广
无物种特异性限制,理论上可用于所有物种。蛋白范围广,胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白、分泌蛋白等皆可检测。
蛋白丰度和分子质量跨度大,可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。
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